【摘要】目的建立并验证复方罗布麻片Ⅰ化学药成分超高效液相色谱法（UPLC）测定方法。方法采用Waters ACQUITY H-Class CYANO（3.0×100 mm，1.8µm），以0.07%的己烷磺酸钠溶液（用磷酸调节pH值至2.75）为流动相A，甲醇:乙腈=5:1为流动相B进行梯度洗脱，流速为0.53 ml/min，柱温30℃。检测波长为275、250 nm，稀释溶剂为0.1 mol/L盐酸。

　　结果硫酸双肼嗪线性范围为38.4～153.6μg/ml，r=0.999 8；氢氯噻嗪线性范围为38.4～153.6μg/ml，r=0.999 9；盐酸异丙嗪线性范围为25.2～100.8μg/ml，r=0.999 8；维生素B1线性范围为12～48μg/ml，r=0.999 9；维生素B6线性范围12～48μg/ml，r=0.999 8。各组分精密度良好，且无明显膜吸附，除硫酸双肼屈嗪外，提取回收率良好。结论该方法可用于测定和评估市售复方罗布麻片Ⅰ化学药成分含量。

　　【关键词】超高效液相色谱法；复方罗布麻片Ⅰ；硫酸双肼屈嗪；中药浸膏；生产工艺

　　复方罗布麻片Ⅰ是由罗布麻叶、野菊花、防己、氢氯噻嗪、硫酸双肼屈嗪及盐酸异丙嗪等10味中西药组成的复方制剂，已广泛应用于高血压临床治疗，效果显著[1-3]。但按现行标准，仅对其中的氢氯噻嗪这一成分进行含量测定，且含量范围为85%～115%，限度范围过宽，不能准确控制氢氯噻嗪的含量。同时，现行标准也未对硫酸双肼屈嗪、盐酸异丙嗪、维生素B1以及维生素B6进行含量测定，故导致各生产企业在依法投料后却忽视了各主要成分混合并经过一系列的生产过程后的含量变化[4-7]。且本单位通过前期研究表明，该复方制剂中中药浸膏在某些条件下会影响硫酸双肼屈嗪的含量。故本单位拟通过采用超高效液相色谱法（UPLC），全面分析制剂中的氢氯噻嗪、硫酸双肼屈嗪、盐酸异丙嗪、维生素B1以及维生素B6的含量，一方面为全面控制市售复方罗布麻片Ⅰ的质量提供可靠的检测方法，另一方面为验证前期的研究的设想，此处方是否在一定程度上存在缺陷。

　　1材料

　　1.1试剂与药品

　　己烷磺酸钠、甲醇、乙腈为色谱纯，无水乙醇、盐酸、磷酸为分析纯，试验用水为实验室自制超纯水。市售复方罗布麻片Ⅰ3批（A，180508；B，D180802；C，180581），规格为氢氯噻嗪1.6 mg/片、硫酸双肼屈嗪1.6 mg/片、盐酸异丙嗪2.1 mg/片、维生素B1 0.5 mg/片、维生素B6 0.5 mg/片。

　　1.2对照品

　　试验所用对照品购自中检院。氢氯噻嗪（100309-201404，99.7%）、硫酸双肼屈嗪（100514-201102，85.5%）、盐酸异丙嗪(100422-201603，99.5%)、维生素B1（100390-20180，97.9%）、维生素B6（100116-201705，100.0%）。

　　1.3仪器

　　Waters Acquity H-Class超高效液相色谱仪（含waters 2996二极管阵列检测器，waters Empower工作站）；XP205电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；HS10260D超声波清洗器（260 W超声功率可调，中国天津市鑫洲科技有限公司）；振荡仪。本试验所用所有仪器与量具均经校正或检定。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件

　　色谱柱：Waters ACQUITY H-Class CYANO（3.0×100 mm，1.8µm），以0.07%的己烷磺酸钠溶液（用磷酸调节pH值至2.75）为流动相A，甲醇:乙腈=5:1为流动相B，按表1程序进行梯度洗脱。流速为0.53 ml/min，柱温30℃，检测波长：氢氯噻嗪、硫酸双肼屈嗪以及维生素B1为275 nm、盐酸异丙嗪及维生素B6为250 nm，稀释溶剂：0.1 mol/L盐酸。

　　2.2溶液的制备方法

　　2.2.1对照品储备液的制备方法

　　精密称取氢氯噻

　　嗪32 mg、硫酸双肼屈嗪32 mg、盐酸异丙嗪21 mg、维生素B1 10 mg、维生素B6 10 mg置同一50 ml量瓶中，加入稀释溶剂约35 ml，冰水浴超声10 min使溶解，并用稀释溶剂定容至刻度，制成含1ml含氢氯噻嗪640ng、硫酸双肼屈嗪640ng、盐酸异丙嗪420ng、维生素B1 200ng、维生素B6 200ng。

　　2.2.2标准溶液的制备方法

　　样品溶液中氢氯噻

　　嗪、硫酸双肼屈嗪、盐酸异丙嗪、维生素B1、维生素B6浓度依次为64.0、64.0、42.0、20.0、20.0 ng/ml。分别移取对照品储备液适量，至适宜规格容量瓶中，加稀释溶剂至刻度，摇匀，标准曲线序号1、2、3、4、5、6溶液分别制成含60%、80%、100%、120%、160%、240%样品溶液中各成分浓度的标准曲线溶液，具体配置方法详见表2。

　　2.2.3加样回收率溶液的制备方法

　　精密称取样品

　　细粉2片量置50 ml量瓶中，平行制备9份。依次移去对照储备液4 ml、5 ml、6 ml分别置于不同的量瓶中，每个浓度制备3份，加入稀释溶剂约25 ml，冰水浴超声10 min使溶解，并用稀释溶剂定容置刻度，取上清液离心后，用0.22μm膜过滤后进样。

　　精密称取样品细粉2片量置50 ml量瓶中，平行制备2份，加入稀释溶剂约35 ml，冰水浴超声10 min使溶解，并用稀释溶剂定容置刻度，取上清液离心后，用0.22μm膜过滤后进样。

　　出峰先后顺序依次为维生素B6、维生素B1、硫酸肼屈嗪、氢氯噻嗪以及盐酸异丙嗪，各组分在275 nm下均有吸收，故以275 nm为系统适用性积分波长，分离度依次为5.5、4.1、11.5、24.5，各组分间均能完全分离，且各成分理论踏板数不小于10 000。

　　2.4专属性

　　空白溶液无干扰，各待测成分能完全分离。见图1～6。

　　2.5线性范围

　　硫酸双肼嗪线性范围为38.4～153.6μg/ml，y=941.6x+208.6，r=0.999 8；氢氯噻嗪线性范围为38.4～学硫酸双肼嗪线性范围为38.4～153.6μg/ml，y=153.6μg/ml，y=3 607.3x+8 946.7，r=0.999 9；盐酸异丙嗪线性范围为25.2～100.8μg/ml，y=455.9x+938.2，r=0.999 8；维生素B1线性范围为12～48μg/ml，y=2 024.7x+198.4，r=0.999 9；维生素B6线性范围为12～48μg/ml，y=1 009.7x+490.1，r=0.999 8。

　　2.6精密度

　　2.6.1对照品进样重复性

　　按“标准溶液的配制”项下操作，配制标曲3溶液，并进样6次，对照品进样重复性数据详见表3。硫酸双肼屈嗪、氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、维生素B1、维生素B6的相对标准偏差（RSD）小于1%，进样重复性良好，符合要求。

　　2.6.2对照品稳定性对照品进样架放置4、8、12 h后，硫酸双肼屈嗪、氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、维生素B1、维生素B6峰面积无明显变化，对照品进样架放置12 h后稳定，对照品稳定性实验结果数据详见表4。

　　2.7准确度(样品加标回收率)

　　取提取回收率溶液，每份进一针，结果表明，氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、维生素B1、维生素B6提取回收率良好，且RSD符合规定。硫酸双肼屈嗪提取回收率较低，但平行性较好，样品加标回收率实验结果数据详见表5。

　　2.8对照品溶液膜过滤实验

　　按“标准溶液的配制”项下操作，配制标曲3溶液，用0.22μm膜过滤，依次取未弃初滤液，弃去1、2、3、4、5 ml初滤液溶液进样，每份进样3次，对照品溶液膜过滤实验结果详细数据请见表6。结果表明硫酸双肼屈嗪、氢氯噻嗪、盐酸异丙嗪、维生素B1、维生素B6无明显膜吸附现象，但是建议还是弃去2～3 ml初滤液后取溶液进样。

　　2.9耐用性

　　本研究尝试了调整流动相pH以及柱温，方法耐用性实验结果表7所示，结果表明本方法可一定程度上耐受pH及柱温变化。但柱效略有下降，尤以维生素B6及维生素B1较明显，但大于5 000。